Jegyzetek medikusoknak/Mikrobiológia/Általános virológia/A vírusfertőzések laboratóriumi diagnosztikája

Vizsgálati anyagok vétele és beküldése

Mintavétel

lokális fertőzés esetén az elváltozás helyéről kell venni
szervi vagy szisztémás fertőzés esetén a test különböző helyeiről kell mintát venni
enteralis fertőzések kimutatása a székletből lehetséges
biopszia vétele szükséges lehet:
- vírusos encephalitisben, ha azt arbo- vagy robovírus okozza
  - ezek nem jelennek meg a liquorban
- tisztázatlan etiológiájú perzisztens fertőzésekben
- immunszuppresszáltakban vírusos pneumonia esetén alveolaris mosófolyadékot célszerű beküldeni

Tárolás és szállítás

virális transzportközegeket kell használni, ezek tartalmaznak:
- fehérjét
- neutrális pH-jú puffert
- antibiotikumokat és antifungális szereket
4 °C-on 24 óráig tarthatók el a minták biztoságosan
az olvasztás és a fagyasztás kerülendő, egyes vírusokat inaktivál
- hosszú távú tárolás -70 °C-on lehetséges

Feldolgozás

a baktériummentes minták közvetlenül leolthatók
kontaminált mintákat antibiotikummal, éterrel vagy baktériumszűrővel lehet kezelni
a szöveti minták kezelése tripszines szeparálással kezdődik, ezután:
- közvetlen tenyésztés
- kokultiváció fogékony sejtekkel

Vírusok tenyésztése

Állatoltás

főleg történeti jelentősége van
- az influenzát vadászgörényben,
- a poliovírust majomban sikerült izolálni
problémák:
- nehéz fogékony állatot találni
- általában nem specifikusak a tünetek
- a kísérleti állatban jelen lehet látens fertőzés
ma is használják a coxsackie A és B csoport elkülönítésére
- a vírust szopós egerekbe oltják
- az A csoport petyhüdt bénulást okoz (izomnecrosist)
- a B csoport spasticus bénulást (encephalitist)

Embrionált tojás

7-12 napos, embrionált tojást használnak
- ebben sokfajta, de nem minden emberi vírus szaporítható
- a csirkeembrió immunológiailag inaktív
az egyes vírusok ideális oltási helye eltérő lehet:
- chorioallantois-membránra oltják a poxvírusokat és a herpesvírusokat
  - a fertőzött membránon szürkésfehér csomócskák, pock-ok jelennek meg
- amnionba oltják az influenzavírusokat és a mumpsvírust
  - ezek allantoisban is szaporíthatók a tojáshoz való adaptálás után
az embrionált tojás igen fogékony az influenza A iránt
- főleg a vakcinák előállításához szükséges vírus előállításához használják

Sejtkultúrák

primer tenyészetek
- állati szervekből vagy emberi embriókból készítik
- a feldarabolt szövetdarabot tripszinnel emésztik, majd a sejteket tápoldatba helyezik
- a sejteknek ugyanazok a tulajdonságai, mint az intakt sejtnek
- perifériás vérből kialakított mononukleáris sejtkultúrán szaporítják a HIV-et
diploid sejtvonalak
- 50-60 cikluson át passzálhatók, ezután csökken a szaporodóképesség, és a tenyészet kihal
- az eredeti karyotípus megmarad
- kialakíthatók:
  - embrionális tüdőből
  - bőrből
  - tonsillából
folyamatos sejtvonalak
- immortalizált sejtvonalak, korlátlanul passzálhatók
- eretük lehet:
  - embrionális
  - felnőtt
  - tumoros
- a kromoszómaszám változó, heteroploid sejtvonalak
- gyakran használt sejtvonalak:
  - majom-veseszövetből: Vero, BSC-1
  - emberi méhnyakrákból: HeLa
  - emberi gégerákból: HEp-2
  - emberi T-sejtes leukaemia- vagy lymphoma-eredetű sejtvonalakban is tenyésztenek HIV-et

Vírusok kimutatása

Kimutatás tenyészetekben

Natív mikroszkópos vizsgálattal

destrukció
- a sejtek lekerekedésével kezdődik
- ezután változik meg a sejtek fénytörése
- végül a sejtek leválnak a tenyésztőedény faláról és elpusztulnak
syncytium-képződés
- főleg a paramyxovírusokra és a CMV-re jellemző
transzformáció
- polyomavírussal vagy sarcomavírussal fertőzött állati sejtvonalakban jelentkezik
- a rutin diagnosztikának nem része

Festett készítmény mikroszkópos vizsgálatával

ilyenek a zárványok
- alkothatják:
  - a vírus struktúrfehérjéi
  - a sejt fertőzés miatt keletkezett kóros anyagcsere-termékei
- elhelyezkedhet:
  - a citoplazmában:
    - paramyxovírusok
    - poxvírusok
    - reovírusok
    - rhabdovírusok
  - a magban:
  - egyidejűleg a magban és a citoplazmában:
    - morbilli
    - CMV

Indirekt kimutatási lehetőségek

hemagglutináció
- úgy alakul ki, hogy a vírusok hidakat képeznek a VVT-ken lévő receptorokhoz való kötődéssel
- pozitív esetben a VVT-k nem ülepszenek le
- így mutathatók ki az influenzavírusok az embrionált tojásból
hemadszorpció
- ha a vírusnak van hemagglutininje, akkor ez a fertőzött sejtek felszínén is megjelenik
- ezek a sejtek bizonyos fajú VVT-ket megkötnek
- így mutathatók ki az orthomyxovírusok és paramyxovírusok
vírusspecifikus antigének
- detektálásuk IF, RIA vagy ELISA módszerrel történik
vírusinterferencia
- azt használják ki, hogy egy sejt fertőzése egy nem citopátiás vírussal megakadályozhatja bizonyos másik vírussal való fertőződést
- a rubeola kimutatására használják:
  - ez primer majomvese-kultúrában jól szaporodik, citopátiás hatása nincs
  - az echovírusok rövid idő alatt elpusztítják ezeket
  - ha a mintában rubeolavírus volt jelen, akkor a vele kezelt sejteken az echovírusnak nincs citopátiás hatása

Gyors diagnosztikai módszerek

Fénymikroszkópos módszerek

rutinszerűen alkalmazott, olcsó eljárások
HSV vagy VZV kimutatása
- a vesiculumok basalis részéről vett kaparékot festik Giemsával, ez a Tzank-kenet
- duzzadt magvú óriássejtek utalnak a fertőzésre
kanyaró kimutatása
- ekkor a Koplik-folt jelenléte utal a kanyaróra
CMV kimutatása a cytomegaliás sejtek jellemzőinek azonosításával történik:
- keskeny cytoplazmaszegély
- nagy mag
- benne halvány udvarra övezett basophil zárványtest
veszettség kimutatása
- az idegsejtekben kerek vagy ovális eosinophil zárványtestek vannak
- bennük basophil foltok

Elektronmikroszkópia

nagyon költséges és nem túl érzékeny módszer
az astrovírusok esetében használják, ahol nincs más diagnosztikus lehetőség

Sejtekben lévő antigén kimutatása

immunfluoreszcens módszer (IF)
- herpesvírusok és számos felső légúti vírusfertőzés kimutatására alkalmas
- a kaparékból centrifugálással nyerik ki a sejteket, majd tárgylemezre fixálják
- ezután direkt vagy indirekt IF-fel mutatják ki az antigéneket
immunperoxidáz módszer (IP)
- jól használható a CMV kimutatására leukocytákban
- ezzel kimutatható a HSV encephalitisben és a rabiesvírus is

Extracelluláris antigének kimutatása

szilárd fázisú immunassay
- a szilárd fázishoz vannak kötve az antitestek
- ilyen az ELISA
- kimutatható vírusok:
  - HBV
  - rotavírus
  - enteralis adenovírusok
  - respiratory syncytial virus
  - HIV
  - HSV

A vírus-nukleinsav kimutatása

régebben hibridizációt, ma PCR-t használnak
- a PCR igen kis mennyiségű vírust is ki tud mutatni
- emiatt alkalmas HSV-encephalitis és HIV kimutatására
- szintén hasznos olyan esetben, amikor a vírus sejttenyészetben nem szaporítható, ilyenek:
  - HCV
  - parvovírus B19

Szerológiai módszerek

Az immunglobulinok jelentősége

IgM jelenléte primer vírusfertőzést jelez
IgG jelen van primer és korábbi fertőzésben is
titerük pontos megállapítása merkaptánokkal lehetséges

Vírusneutralizációs próba

a gyakorlati alkalmazás limitált
- egy vizsgálathoz sok állatra, embrionált tojásra vagy sejtre van szükség
vírusvakcinák hatékonyságának mérésére is használják

Complementkötési reakció

nem típus, hanem csoportspecifikus próba
előnye, hogy a komplementkötő ellenanyagok hamarabb megjelennek, mint a neutralizálók
munkaigényessége miatt visszaszorulóban van az alkalmazása

Hemagglutináció-gátlás

ha a hemagglutinin egyben a fertőzőképességért felel, a neutralizációs próbával azonos eredményt ad

Hemadszorpció-gátlás

olyan vírusokra használható, amiknek nincs, vagy csekély a cytopathiás hatása

Immunfluoreszcencia

a tárgylemezre fertőzött sejteket fixálnak
ezekhez kötődnek a beteg ellenanyagai, ha vannak
ezeket jelzett, monoklonális anti-humán-immunglobulinokkal mutatják ki

Enzimimmunoassay

a kimutatás pontosságát akadályozzák az esetlegesen jelen lévő rheumafaktor anti-IgG IgM-ek
ezt a reverz ELISA módszer kifejlesztésével oldották meg
- itt a szilárd fázisra eleve anti-IgM ellenanyag van kötve
- a jelzett antitest nem a humán Ig-re, hanem a vírusantigénre specifikus
- így az IgM titer megmérhető anélkül, hogy a specifikus IgG-k az RF-en keresztül meghamisítanák az eredményt